聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE)
支持介质:丙烯酰胺(Acr)与交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)聚合形成的凝胶,孔径可通过调整 Acr/Bis 比例控制(5%-20% 凝胶对应不同孔径)。
核心特点:孔径小(1-10nm)、分辨率极高(可区分分子量相差 1kDa 的蛋白质)、重复性好。
适用对象:小分子物质,如蛋白质、小分子 DNA(<1kb)、RNA。
关键分支:
SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠 - PAGE):常用的蛋白质分析技术。SDS 是阴离子去污剂,可使蛋白质变性并结合等量 SDS(每克蛋白质结合 1.4g SDS),消除蛋白质自身电荷差异,仅通过分子大小实现分离,可用于蛋白质分子量测定、纯度鉴定。
Native-PAGE(非变性 PAGE):不添加 SDS 和还原剂,蛋白质保持天然构象和电荷,分离依赖 “电荷 + 大小 + 形状”,可用于分析蛋白质活性、复合物组成。
典型操作流程(以 SDS-PAGE 为例)
凝胶制备:根据目标蛋白质分子量配置凝胶(小分子用高浓度胶,如 15%;大分子用低浓度胶,如 8%),分为 “分离胶”(下层,起分离作用)和 “浓缩胶”(上层,使样品浓缩成窄带,提高分辨率)。
样品处理:蛋白质样品与 SDS 上样缓冲液(含 SDS、还原剂 β- 巯基乙醇、溴酚蓝指示剂)混合,95℃加热 5-10 分钟,使蛋白质变性并结合 SDS。
上样与电泳:将处理好的样品加入凝胶加样孔,同时加入 “蛋白质分子量标准品”(Marker),接通电源(浓缩胶用低电压,分离胶用高电压),溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部时停止电泳。
检测与分析:
染色:常用考马斯亮蓝染色(简单快速,检测限~0.1μg)或银染(灵敏度高,检测限~1ng);
成像与分析:通过凝胶成像仪拍摄条带,结合 Marker 判断目标蛋白质的分子量,通过条带亮度半定量分析蛋白质含量。
后处理(保证涂层性能稳定)
烘干固化:将工件放入高温烘箱,按涂料要求控制温度(阴极电泳 160-180℃,阳极电泳 140-160℃)和时间(20-40 分钟),使涂层交联固化,形成终的机械性能和耐腐蚀性(固化参数直接影响涂层硬度、附着力)。
冷却检验:工件自然冷却后,检测涂层外观(无流挂、针孔、色差)、厚度(用膜厚仪测量)、附着力(划格法测试,需达到 GB/T 9286 标准 0 级或 1 级)、耐腐蚀性(盐雾测试、耐溶剂测试)。
纯水洗
目的:用去离子水(电导率<10μS/cm)终清洗,彻底去除工件表面的离子杂质(如钙、镁离子)。
工艺:浸泡或喷淋,时间 1-2 分钟,防止后续电泳时产生针孔、缩孔等缺陷。
烘干
目的:去除工件表面的水分,避免电泳时水分带入槽液导致涂层出现气泡。
工艺:在 80-120℃烘箱中烘干,时间 15-30 分钟(根据工件大小调整),确保表面完全干燥。