典型操作流程(以 SDS-PAGE 为例)
凝胶制备:根据目标蛋白质分子量配置凝胶(小分子用高浓度胶,如 15%;大分子用低浓度胶,如 8%),分为 “分离胶”(下层,起分离作用)和 “浓缩胶”(上层,使样品浓缩成窄带,提高分辨率)。
样品处理:蛋白质样品与 SDS 上样缓冲液(含 SDS、还原剂 β- 巯基乙醇、溴酚蓝指示剂)混合,95℃加热 5-10 分钟,使蛋白质变性并结合 SDS。
上样与电泳:将处理好的样品加入凝胶加样孔,同时加入 “蛋白质分子量标准品”(Marker),接通电源(浓缩胶用低电压,分离胶用高电压),溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部时停止电泳。
检测与分析:
染色:常用考马斯亮蓝染色(简单快速,检测限~0.1μg)或银染(灵敏度高,检测限~1ng);
成像与分析:通过凝胶成像仪拍摄条带,结合 Marker 判断目标蛋白质的分子量,通过条带亮度半定量分析蛋白质含量。
技术优势与局限性
优势:
分辨率高:可区分结构 / 性质极相似的物质(如不同亚型的蛋白质、仅差 1 个碱基的 DNA 片段);
样品用量少:仅需微克(μg)甚至纳克(ng)级样品;
操作灵活:可通过调整介质、缓冲液、电场参数适配不同样品。
局限性:
部分技术(如 PAGE)操作较繁琐,对实验条件要求高(如凝胶制备需避免气泡);
变性电泳(如 SDS-PAGE)会破坏生物活性,无法用于活性物质纯化;
大分子物质(如基因组 DNA)分离效率较低,需结合脉冲场凝胶电泳(PFGE)等特殊技术。
总之,电泳是现代实验室 “分离分析” 的基石,其技术发展(如与质谱、色谱联用)进一步拓展了在医学、组学研究等领域的应用边界。
预脱脂
目的:初步去除工件表面的大量油污、灰尘(尤其是机加工残留的切削油、冲压油)。
工艺:将工件浸入或喷淋碱性脱脂剂(含氢氧化钠、碳酸钠、表面活性剂等),温度 50-60℃,时间 3-5 分钟。
作用:减轻后续主脱脂的负担,避免油污污染后续槽液。
后处理阶段(固化:形成终涂层性能)
通过高温固化使湿膜交联成致密的干膜,赋予涂层硬度、耐腐蚀性等关键性能。
沥干
操作:将工件悬挂沥干表面水分,避免烘干时水分聚集导致涂层流挂。
烘干固化
核心:通过高温使涂料中的树脂、交联剂发生化学反应,形成三维网状结构。
关键参数:
温度:阴极电泳 160-180℃,阳极电泳 140-160℃(需根据涂料类型调整,误差 ±5℃);
时间:20-40 分钟(从工件达到设定温度开始计时,确保完全固化)。
注意:升温速率需控制(通常 5-10℃/min),避免涂层因急剧升温产生气泡。
冷却
操作:工件从烘箱取出后自然冷却至室温(或强制风冷),避免高温下接触灰尘。
检验与修整
检测项目:
外观:无针孔、流挂、色差、缩孔等缺陷;
性能:膜厚(20-50μm,用膜厚仪测量)、附着力(划格法测试,需达 0 级或 1 级)、耐腐蚀性(盐雾测试、耐冲击性);
修整:轻微缺陷(如小颗粒)可打磨后补涂,严重缺陷需退膜返工。